Zusammenfassung
Das Verständnis der Beziehung zwischen struktureller Dynamik und Funktion von Proteinen ist sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die Biotechnologie von entscheidender Bedeutung. Die Methoden zur Untersuchung der schnellen Dynamik struktureller Veränderungen sind jedoch begrenzt. Hier stellen wir fluoreszierende Nanoantennen als spektroskopische Technik vor, um Konformationsänderungen von Proteinen durch nicht-kovalente Farbstoff-Protein-Wechselwirkungen zu erfassen und zu melden. Mithilfe von Experimenten und molekularen Simulationen konnten wir fünf verschiedene Konformationszustände der intestinalen alkalischen Phosphatase nachweisen und charakterisieren, darunter auch den transienten Enzym-Substrat-Komplex. Außerdem haben wir die Universalität der Nanoantennenstrategie mit einem anderen Modellprotein, Protein G und seiner Wechselwirkung mit Antikörpern, untersucht und eine schnelle Screeningstrategie zur Identifizierung effizienter Nanoantennen demonstriert. Diese vielseitigen Nanoantennen können mit verschiedenen Farbstoffen verwendet werden, um kleine und große Konformationsänderungen zu überwachen, was darauf hindeutet, dass sie zur Charakterisierung verschiedener Proteinbewegungen oder in Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen eingesetzt werden könnten.
Hauptseite
Die experimentelle Untersuchung von Übergangszuständen von Proteinen1 stellt nach wie vor eine große Herausforderung dar, da Techniken mit hoher Strukturauflösung, wie z. B. kernmagnetische Resonanz und Röntgenkristallografie, oft nicht direkt zur Untersuchung kurzlebiger Proteinzustände eingesetzt werden können. Im Gegensatz dazu eignet sich die Fluoreszenzspektroskopie mit hoher zeitlicher Auflösung besser für den Nachweis von Übergangszuständen2,3 und ist darüber hinaus bequem, hochempfindlich und weithin verfügbar. Während große Konformationsänderungen oft mit Hilfe der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz4 nachgewiesen werden können, werden solche im Bereich von ~3-9 nm in der Regel mit Hilfe des Förster-Resonanz-Energietransfers (FRET) nachgewiesen. FRET erfordert jedoch die komplizierte Chemie der ortsspezifischen Insertion von Fluorophoren5,6. Daher besteht trotz großer Fortschritte bei den Fluoreszenztechniken7,8,9,10 nach wie vor ein ungedeckter Bedarf an empfindlichen Strategien, die in der Lage sind, die kleinen Konformationsänderungen11 nachzuweisen, die einige Proteine während ihrer Funktion, z. B. bei der Enzymkatalyse12, erfahren, sowie an einfacheren und effizienteren Markierungsstrategien.
Hier berichten wir über den Entwurf, die Entwicklung und die Anwendung eines vielseitigen Werkzeugs, der fluoreszierenden Nanoantennen, die Konformationsänderungen von Proteinen und damit auch deren Funktion in Echtzeit erkennen und melden. Da die weit verbreiteten Fluoreszenzfarbstoffe nur eine geringe Affinität zu Proteinen aufweisen13,14 , sind diese Nanoantennen so konzipiert, dass sie nichtkovalente Farbstoff-Protein-Wechselwirkungen auslösen und somit sehr empfindlich auf Konformationsänderungen reagieren. Jeder Farbstoff sollte je nach seiner strukturellen Komplementarität und seinen chemischen Eigenschaften eine Affinität für eine andere Region eines Proteins haben. Mit Hilfe der hochprogrammierbaren Phosphoramidit-Chemie haben wir daher Nukleinsäure- (DNA) und Polyethylenglykol- (PEG) Nanoantennen synthetisiert, die Farbstoffe und andere funktionelle Modifikationen enthalten. Außerdem nutzten wir die Vorteile der nicht-kovalenten Biotin-Streptavidin (SA)-Interaktion, die eine schnelle und einfache Verbindung von Biotin-markierten Nanoantennen mit Biotin-markierten Proteinen ermöglicht.
Als erstes Modellprotein, um zu testen, ob Nanoantennen die Aktivität von Proteinen nachweisen können, wählten wir die alkalische Phosphatase (AP; EC 3.1.3.1)15 von Kälberdarm. Die Untersuchung der intestinalen AP ist ein aktives Forschungsgebiet16, da sie eine wichtige Rolle bei der Verhinderung von Entzündungen17, der Förderung des Wachstums der kommensalen Mikrobiota18, der Regulierung des pH-Werts19, der Aktivierung von Prodrugs20,21 und der Untersuchung der grundlegenden Biophysik22 spielt. APs wurden mit Brust-, Prostata-, Darm- und Magenkrebs23,24,25,26, dem metabolischen Syndrom27, Hypophosphatasie28,29, Herzinfarkt30, chronischer Darmentzündung31 und sogar SARS-CoV-2-Infektionen32 in Verbindung gebracht. Dieses Enzym wurde durch Kristallographie33,34,35, computergestützte Simulationen36, Entfaltung37, Inhibitoren38,39, Mutationen40 und Hydrolyse von Substraten40,41 charakterisiert. Klassische42,43 und neuere Strategien44,45,46 zur Charakterisierung der AP-vermittelten Hydrolyse in Echtzeit beinhalten die Überwachung der Geschwindigkeit der Produktbildung (Erweiterte Daten, Abb. 1). Leider erfordern diese Assays synthetische Substrate, um ein Signal zu liefern, während biomolekulare Substrate von AP spektroskopisch stumm sind (z. B. Nukleotidtriphosphate)18,19. Für Biomoleküle erlaubt der standardmäßige Malachitgrün-Assay keine Echtzeitanalyse47, während alternative biomolekulare Assays nicht universell sind48,49. Die isotherme Titrationskalorimetrie50,51 kann die AP-Aktivität für biologische Substrate charakterisieren52, eignet sich jedoch nicht für ein Hochdurchsatz-Screening. Uns sind keine FRET-Studien bekannt, bei denen AP markiert wurde, was vermutlich auf die geringen Konformationsänderungen dieses Proteins zurückzuführen ist34,53. Hier haben wir fluoreszierende Nanoantennen entwickelt, ihren Signalmechanismus untersucht und sie zur Untersuchung der Funktion von AP sowie eines zweiten Proteinsystems, Protein G, das mit verschiedenen Antikörpern interagiert, eingesetzt54.
Ergebnisse
Mechanismus der fluoreszierenden Nanoantennen
Wir fassen die allgemeine Idee unserer Strategie in Abb. 1a zusammen. Die fluoreszierenden Nanoantennen auf DNA- oder PEG-Basis enthalten an einem Ende einen fluoreszierenden Farbstoff, z. B. Fluorescein (FAM), und am anderen Ende Biotin, um die Anbringung zu erleichtern (Start). Unter Verwendung von Biotin banden wir die Nanoantenne an tetrameres SA des Wildtyps von Streptomyces avidinii, das über vier Biotin-Bindungsstellen verfügt, und beobachteten eine Abnahme (oder ein Quenching) der FAM-Fluoreszenz (Schritt 1). Docking-Simulationen (Abb. 1b), experimentelle Beweise (Erweiterte Daten, Abb. 2) und frühere Studien55,56 legen nahe, dass FAM in der Nähe der unbesetzten Biotin-Bindungsstellen von SA bindet. Als Nächstes fügten wir das Modellprotein biotinylierte alkalische Phosphatase (bAP) vom Kalbsdarm hinzu. Im Gegensatz zur spezifischen Farbstoffmarkierung, die für FRET-Experimente erforderlich ist, kam bei unserer Methode die unspezifische Biotinylierung zum Einsatz, die bei vielen Proteinen problemlos durchgeführt werden kann, ohne ihre Funktion zu beeinträchtigen57. Die Bindung von bAP an die Nanoantennen-SA-Plattform führt zu einem Anstieg des Fluoreszenzsignals (Schritt 2), was darauf hindeutet, dass FAM von SA freigesetzt wird. Bei Zugabe eines AP-Substrats erzeugt die Nanoantenne einen vorübergehenden Fluoreszenz-‘Spike’ (Schritt 3), der eine Echtzeitüberwachung des vorübergehenden substratgebundenen Zustands des Enzyms ermöglicht. Dieses Ergebnis in Verbindung mit Docking-Simulationen (Abb. 1c) legt nahe, dass FAM in der Nähe einer der beiden äquivalenten aktiven Stellen bindet.
